CNSH Tăng Lê Thái Ngọc – IVFMD Tân Bình

Giới thiệu chung

Duy trì pH thích hợp trong nuôi cấy in vitro và các thủ thuật IVF là điều thiết yếu để đảm bảo sự phát triển bình thường của phôi. Dao động pH ảnh hưởng đáng kể đến nhiều quá trình sinh học như chuyển hóa, điện thế màng, sản xuất ATP, tổ chức khung xương tế bào và duy trì độ toàn vẹn nhiễm sắc thể. Trong khi đó, noãn MII được thu nhận sau thủ thuật chọc hút chỉ có một số chất trao đổi HCO₃⁻/Cl⁻ ở trạng thái hoạt động, không có chất trao đổi Na⁺/H⁺ nên phụ thuộc hoàn toàn vào tế bào cumulus để điều hòa pH nội bào. Trong ICSI, việc loại bỏ tế bào cumulus khiến noãn trần dễ tổn thương và phụ thuộc hoàn toàn vào pH môi trường đệm. Do đó, việc lựa chọn hệ đệm có thể ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của phôi và kết quả lâm sàng.
Các hệ đệm lưỡng cực (zwitterionic) như HEPES và MOPS giúp ổn định pH trong điều kiện khí quyển nhờ cấu trúc phân tử cho phép thu nhận và giải phóng hiệu quả các ion H⁺ tự do trong dung dịch. Tuy vậy, các chất đệm zwitterionic này có thể không phải là lựa chọn tối ưu cho thủ thuật ICSI do khả năng xâm nhập vào noãn sau khi màng bào tương bị đâm thủng. Các nghiên cứu cho thấy HEPES và MOPS có thể ức chế kênh vận chuyển, tương tác với ion kim loại thiết yếu, DNA và tạo gốc oxy tự do, đồng thời ảnh hưởng đến lipid màng và cấu trúc protein.
Mặc dù các tác động của việc nuôi cấy tế bào trong môi trường chứa HEPES và MOPS đã được mô tả rõ ràng, hiện vẫn chưa rõ liệu môi trường đệm xung quanh có thể xâm nhập vào noãn sau khi màng bị xuyên thủng khi thực hiện thao tác ICSI hay không. Hơn nữa, cũng chưa rõ liệu các đệm zwitterionic có ảnh hưởng đến năng lực phát triển của noãn sau khi được đưa trở lại môi trường nuôi cấy cân bằng CO₂ hay không. Do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát sự xâm nhập của môi trường đệm vào noãn sau khi màng bị xuyên thủng trong thao tác ICSI giả (sham-ICSI) bằng kính hiển vi huỳnh quang đồng tiêu, đồng thời đánh giá ảnh hưởng của sự xâm nhập một số loại đệm chọn lọc đến sự phiên mã (transcriptome) của noãn người giai đoạn MII.
Phương pháp
Tổng cộng có 80 noãn MII không sử dụng cho điều trị được thu thập từ các chu kỳ IVF tại một trung tâm hỗ trợ sinh sản và được chia thành 3 nhóm: (1) tiếp xúc với môi trường đệm bicarbonate (đối chứng), (2) môi trường đệm MOPS và (3) môi trường đệm HEPES. Mỗi nhóm được xử lý tương đương về thời gian tiếp xúc và điều kiện nuôi cấy. Một mô hình “sham-ICSI” (ICSI giả định, không tiêm tinh trùng) được thực hiện trên các noãn đã được tách tế bào cumulus. Trong quá trình này, kim ICSI xuyên qua màng noãn và đưa vào một dung dịch huỳnh quang hoà tan trong môi trường đệm. Sau 30 phút, các noãn quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang đồng tiêu để phát hiện sự hiện diện và phân bố của chất đánh dấu trong bào tương noãn.  
Sau can thiệp, các noãn trong nghiên cứu được tách chiết RNA tổng số và phân tích transcriptome. Phân tích khác biệt biểu hiện gene giữa các nhóm được thực hiện bằng các công cụ thống kê sinh học. Danh sách các gene khác biệt biểu hiện được phân tích với cơ sở dữ liệu Gene Ontology (GO) và Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Mục tiêu là xác định các quá trình sinh học và con đường tín hiệu phân tử bị ảnh hưởng bởi sự xâm nhập của dung dịch đệm vào noãn.
Kết quả
Sau khi màng bào tương noãn bị đâm thủng bằng kim ICSI, các dịch đệm có đánh dấu huỳnh quang đều xâm nhập đáng kể vào bào tương noãn trong vòng 3–5 giây. Dữ liệu RNA-seq cho thấy sự khác biệt đáng kể trong biểu hiện gen giữa nhóm noãn sau khi tiếp xúc với các dịch đệm khác nhau:

• Nhóm HEPES: 564 gen thay đổi biểu hiện so với nhóm chứng (bicarbonate buffer), trong đó 319 gen tăng và 245 gen giảm.

• Nhóm MOPS: 398 gen thay đổi, với 202 gen tăng và 196 gen giảm.

Các gen bị ảnh hưởng liên quan đến nhiều quá trình quan trọng như: phân chia tế bào, tổ chức khung xương tế bào, phản ứng stress, điều hòa phiên mã, chuyển hóa năng lượng và hoạt động ty thể. Cụ thể:

• Ở các nhóm noãn tiếp xúc với dịch đệm sau ICSI, biểu hiện các gen liên quan đến khung xương tế bào giảm đáng kể.

• Nhóm dịch đệm bicarbonate có mức biểu hiện cao hơn của các gen liên quan đến năng lực phát triển phôi như IGF2 và G6PD.

• Các nhóm HEPES và MOPS biểu hiện tăng các gen ức chế phiên mã do stress, điển hình là MAF1.

• Nhóm HEPES cho thấy mức giảm rõ rệt của các gen liên quan đến duy trì nhiễm sắc thể, tiêu biểu là SMC3.

• Ngoài ra, nhóm HEPES biểu hiện tăng các gen liên quan đến stress oxy hóa (GPX1) và stress lysosome (LAMP1).

 
Kết luận
Nghiên cứu này lần đầu tiên chứng minh bằng thực nghiệm rằng các dịch đệm zwitterion như HEPES và MOPS có thể xâm nhập vào bào tương noãn người sau thao tác xuyên thủng màng bào tương trong ICSI. Phát hiện này có ý nghĩa quan trọng vì cho đến nay vẫn chưa có dữ liệu rõ ràng về việc dịch đệm bên ngoài có thể thâm nhập vào noãn hay không.
Kết quả RNA-seq cho thấy sự xâm nhập này không chỉ là hiện tượng vật lý tức thời mà còn kéo theo những thay đổi sâu sắc trong biểu hiện gen của noãn. Điều này có thể ảnh hưởng đến năng lực phát triển của phôi, tương ứng với các nghiên cứu lâm sàng trước đây báo cáo tỉ lệ thụ tinh bất thường, phân mảnh phôi cao, tỉ lệ thai thấp và gia tăng thể khảm khi sử dụng HEPES trong ICSI.
Đặc biệt, các gen liên quan đến ty thể, hệ thống chống stress và sửa chữa DNA bị ảnh hưởng cho thấy khả năng tổn thương chức năng sống còn của noãn sau khi tiếp xúc với các dịch đệm không sinh lý. Từ đó, nhóm tác giả đặt ra nghi vấn liệu việc sử dụng HEPES/MOPS làm dịch giữ noãn trong ICSI có thực sự an toàn, và liệu nên xem xét thay thế bằng đệm bicarbonate truyền thống.

Nguồn: Mendola, R. J., Biswas, L., Schindler, K., Walmsley, R. H., Russell, H., Angle, M., & Garrisi, G. J. (2024). Influx of zwitterionic buffer after intracytoplasmic sperm injection (ICSI) membrane piercing alters the transcriptome of human oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 41(5), 1341-1356.